1 引言(Introduction)
多環(huán)芳烴(PAHs)是一種在海洋底泥中廣泛分布的疏水性有機(jī)污染物(HOCs)(董軍等，2006)，其釋放部分易被水生生物富集，從而影響底棲生物生存和經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品質(zhì)量.因此，監(jiān)測生物體內(nèi)及其暴露環(huán)境中的PAHs含量，對保障養(yǎng)殖區(qū)域環(huán)境及食品質(zhì)量安全非常重要.傳統(tǒng)的通過測定生物體內(nèi)殘留濃度(Cb，lip)來評價(jià)水產(chǎn)品質(zhì)量及其食用風(fēng)險(xiǎn)的方法，需要使用大量溶劑，處理時(shí)間長且操作步驟繁瑣，同時(shí)受生物種類、性別、生長期和健康狀況等因素的影響，導(dǎo)致所獲得的數(shù)據(jù)差別較大(范元中等，2003)，從而影響評價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性.此外，也可通過監(jiān)測養(yǎng)殖區(qū)域生物暴露環(huán)境中(包括生物棲息底泥及孔隙水)污染物的總濃度(陳珊等，2011)，并與底泥質(zhì)量基準(zhǔn)及水環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)對比，評價(jià)養(yǎng)殖區(qū)域的環(huán)境質(zhì)量及污染物對生物的潛在影響.但此種方法忽視了底泥污染物的生物有效性，監(jiān)測結(jié)果與生物體內(nèi)殘留濃度的相關(guān)性較差.
除部分直接以底泥作為食物的生物外，與底泥達(dá)到分配平衡的孔隙水中自由溶解態(tài)物質(zhì)，才是底棲生物攝取的主要對象，是污染物在環(huán)境中遷移、分配及生物累積的驅(qū)動力，因此，底泥孔隙水中自由溶解態(tài)污染物濃度(Cfree)的測定越來越受到關(guān)注.但在底泥多介質(zhì)體系中測定Cfree并不容易，傳統(tǒng)測定底泥孔隙水中Cfree的步驟包括離心、絮凝和測定.但由于孔隙水中沒有任何膠體存在，HOCs在運(yùn)輸和保存過程中會產(chǎn)生不可忽視的損失.近年來，快速發(fā)展的以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料的固相微萃取技術(shù)能夠直接測定Cfree同時(shí)，PDMS具有與生物膜相似的性質(zhì)，也可用于預(yù)測底棲生物對污染物的生物富集程度.因該技術(shù)具有新穎、廉價(jià)和使用方便等特點(diǎn)而越來越受到環(huán)境分析化學(xué)研究工作者的關(guān)注，并得以迅速發(fā)展.
本研究以養(yǎng)殖底泥中的PAHs為研究對象，以其在底泥中的生物有效性為切入點(diǎn)，采用以PDMS為材料的固相微萃取技術(shù)，當(dāng)PDMS中PAHs的濃度(CPDMS)與底泥孔隙水中Cfree達(dá)到分配平衡時(shí)，依據(jù)PDMS具有與水生生物脂肪組織對HOCs相似的吸收和溶解特性，以濾食生活、代謝率低且對污染物的生物富集能力強(qiáng)(劉靜等，2009)的重要海水經(jīng)濟(jì)底棲生物菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)為參照生物，建立代替?zhèn)鹘y(tǒng)底棲生物用于監(jiān)測底泥HOCs污染水平的 “虛擬生物”，同時(shí)建立PDMS與底泥有機(jī)碳標(biāo)化污染物濃度間的定量關(guān)系模型，以期為基于固相微萃取的模擬生物法在養(yǎng)殖區(qū)域中有機(jī)污染物的監(jiān)測提供理論基礎(chǔ).
2 材料與方法
2.1 藥品與試劑
甲醇、二氯甲烷和正己烷均為色譜純(Sigma-Aldrich，USA);乙腈和丙酮均為色譜純(沃凱試劑，中國);氧化鋁、佛羅里硅土、層析硅膠(80~100目)、無水硫酸鈉與銅粉均為分析純(阿拉丁試劑，中國).氧化鋁、弗羅里硅土、硅膠和無水硫酸鈉使用前在馬弗爐中650 ℃烘6 h，置于干燥器中備用;銅粉參照EPA 3660A方法進(jìn)行活化;聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)購自Specialty Silicone Products公司(USA)，使用前切成直徑為16 mm的薄片(厚度0.005 英寸，密度0.972 g · cm-3)，用15mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)溶液超聲清洗20 min，保存于甲醇/水(V/V，1 ∶ 1)溶液中備用.多環(huán)芳烴菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、苯并[k]熒蒽和苯并[a]芘等標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁試劑，中國)購自上海晶純生化科技有限公司.
2.2 底泥采集、分析及加標(biāo)老化
本實(shí)驗(yàn)中所用的底泥采自上海洋山港潮間帶表層底泥，其有機(jī)碳和黑碳的含量分別為0.45%±0.03%和0.11%±0.01%(李娟英等，2015).本研究選取7種具有不同梯度辛醇-水分配系數(shù)(Kow)且檢出頻率較高的PAHs作為監(jiān)測對象，并在海洋環(huán)境底泥風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)分級的基礎(chǔ)上配置3個(gè)濃度梯度，分別為潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)低值(Effects Range Low，ERL，Long et al., 1995)的1、2和3倍.以丙酮為載體，將7種PAHs混合液加入底泥中，混勻，4 ℃避光保存，老化28 d.
2.3 生物累積實(shí)驗(yàn)
菲律賓蛤仔購自上海市蘆潮港菜市場，在鹽度25±2和水溫(20±1)℃且連續(xù)曝氣的條件下馴養(yǎng)3周以上.馴養(yǎng)過程中光周期為16h:8h(光照:黑暗)，每天定時(shí)投加定量三角褐指藻進(jìn)行喂養(yǎng).菲律賓蛤仔的脂肪含量為0.51%±0.15%(測定方法參考GB/T5009.6—2003).
參照EPA方法(EPA 600/R-99/064)，稱取老化后的底泥約2 kg(濕重)放入5 L玻璃缸中，表面覆蓋4 L左右的人工海水(用海水素和蒸餾水配制).靜置1d后，于每個(gè)玻璃缸中放入馴養(yǎng)后活力強(qiáng)、個(gè)體大小相近的蛤仔25只(殼長(32±2)mm、殼高(12±2)mm).采用半靜水式方法(日換水1/2)(周永欣等，1989)進(jìn)行累積實(shí)驗(yàn)，暴露條件同馴養(yǎng)過程且期間不喂食.實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)空白，每個(gè)濃度梯度設(shè)置兩個(gè)平行，持續(xù)28 d.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將菲律賓蛤仔和底泥取出，冷凍干燥后磨碎備用.
2.4 固相微萃取測定底泥孔隙水中Cfree
根據(jù)Li等(2013)的計(jì)算方法，稱取400 g(濕重)底泥于1 L藍(lán)口瓶中，加入200 mL人工海水(底泥含水率控制在60%~70%)、氯化汞(底泥干重的0.15%)和1片潔凈的PDMS薄膜.置于振蕩器上連續(xù)振蕩28 d(20 ℃，200 r · min-1)以達(dá)到平衡.設(shè)置1個(gè)空白對照，每個(gè)濃度梯度設(shè)置2個(gè)平行.
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用鑷子將PDMS薄膜取出，用超純水洗凈后置于鋁箔上晾干，再用15 mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)超聲萃取2次，將2次萃取液混合后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2~3 mL，用柔和的氮?dú)獯抵两桑译娑ㄈ葜? mL，待測.
2.5 PAHs的萃取、凈化及測定
本文中PAHs的萃取、凈化及測定參照本實(shí)驗(yàn)室Li等(2015)的方法.簡述如下，稱取底泥樣品3 g或生物樣品1 g放入索氏提取器中，加100 mL丙酮/正己烷(V/V，1 ∶ 1)，于65 ℃水浴中回流萃取24 h.底泥萃取液過裝有4 g無水硫酸鈉、4 g氧化鋁和8 g中性硅膠的層析柱凈化;生物萃取液過裝有8 g佛羅里硅土和2 g銅粉的層析柱凈化.底泥及生物萃取液均用20 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，用柔和的氮?dú)獯抵两桑译娑ㄈ葜? mL，待測.PAHs的測定采用Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱進(jìn)行分離分析.氣相條件及質(zhì)譜條件與Li等(2015)相同.底泥和菲律賓蛤仔樣品提取前，進(jìn)行3個(gè)加標(biāo)濃度梯度樣品的回收率實(shí)驗(yàn)，回收率平均值為75%~120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7%~12%.所有樣品的測定均設(shè)置全流程空白實(shí)驗(yàn)及兩個(gè)平行.
3 結(jié)果與討論
3.1 固相微萃取模擬生物法用于底泥孔隙水中Cfree的測定
底泥孔隙水中PAHs總濃度(Cwater)可以通過底泥中PAHs總濃度(CS，OC)及底泥有機(jī)碳-水分配系數(shù)(KOC)計(jì)算得到(表 1).然而，Cwater包括Cfree和溶解性有機(jī)碳(DOC)結(jié)合態(tài)濃度(Allan et al., 2012)，但結(jié)合態(tài)污染物因其極性太強(qiáng)或者體積太大不能被生物體吸收，即不具有生物有效性.Hunter等(2009)的研究也表明，只有自由溶解態(tài)的分子才能夠穿過生物膜被生物吸收.與上述方法相比，固相微萃取PDMS中只富集自由溶解態(tài)的污染物(Mayer et al., 2003)，因此，可根據(jù)PDMS中污染物的濃度CPDMS和PDMS-水分配系數(shù)(KPDMS-w)計(jì)算孔隙水中的Cfree，從而更真實(shí)地反映孔隙水暴露環(huán)境中PAHs的生物有效性濃度.
表1 PAHs分配常數(shù)及底泥體系各相中PAHs的濃度
?以低濃度梯度底泥為例，表 1列出了PAHs的不同分配系數(shù)和底泥體系各相中PAHs的濃度.由表 1可知，7種PAHs的Cwater均大于Cfree.徐曉陽等(2010)使用土壤-水相分配系數(shù)(Kd)推測的Cwater比使用微萃取方法測得的Cfree大4~5倍，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似.這與Cwater中既包括自由溶解態(tài)的污染物，也包括DOC結(jié)合態(tài)污染物密切相關(guān)(Xia et al., 2013).此外，低環(huán)PAHs的Cwater比Cfree大1~2倍，而高環(huán)PAHs則大5~10倍，說明隨著PAHs環(huán)數(shù)和疏水性(辛醇-水分配系數(shù)Kow)的增加，高環(huán)PAHs更傾向于以DOC結(jié)合態(tài)而非自由溶解態(tài)的形式存在于孔隙水中，從而降低其生物有效性.因此，傳統(tǒng)使用Cwater評價(jià)養(yǎng)殖底泥孔隙水中PAHs暴露水平的方法，因忽視了生物有效性可能導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差.因此，使用以PDMS為材料的固相微萃取模擬生物法測定Cfree，為更好地評估底泥孔隙水中PAHs的真實(shí)暴露水平提供了替代方法.
3.2 固相微萃取模擬雙殼類生物體內(nèi)PAHs的富集
底棲生物體內(nèi)污染物殘留水平檢測是評價(jià)底泥中污染物生物有效性最直接有效的方法(周東星等，2014).由于PDMS基于生物有效性富集底泥中的污染物，因此，具有模擬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)底棲生物體內(nèi)PAHs殘留的潛力.為了確定基于固相微萃取的模擬生物法是否可以模擬菲律賓蛤仔富集底泥環(huán)境中的PAHs，需要比較PDMS與菲律賓蛤仔富集底泥中污染物的途徑，并進(jìn)一步建立兩者富集程度之間的定量關(guān)系.
3.2.1 菲律賓蛤仔與PDMS富集底泥中PAHs的途徑比較
生物富集系數(shù)(BAF)是生物富集最直觀的數(shù)字表達(dá)，BAF(L · kg-1)可用下式計(jì)算得到(Kraaij et al., 2003)：
BAF=Cb，lip/Cfree
式中，Cb，lip為生物體內(nèi)脂肪標(biāo)化的污染物含量(ng · g-1，以lipid計(jì))，Cfree為孔隙水中自由溶解態(tài)污染物濃度(μg · L-1).
由于Kow是描述污染物在水相和有機(jī)相間分配特征的重要參數(shù)，且如果某化學(xué)物質(zhì)在水生生物體內(nèi)的代謝可忽略不計(jì)，則化學(xué)物質(zhì)的Kow值越大，其在生物體內(nèi)生物富集程度越高(胡霞林，2009).本研究中菲律賓蛤仔的BAF值隨著Kow的增大而增加(圖 1)，且lgBAF與lgKow成顯著線性相關(guān)(y=x-0.613(R2=0.92，r=0.96，p<0.01)).由于Kow表示化學(xué)物質(zhì)在正辛醇相與水相間達(dá)到分配平衡時(shí)的濃度比(王翊如等，1999)，因而lgBAF與lgKow的顯著相關(guān)表明，底泥孔隙水中自由溶解態(tài)的PAHs在菲律賓蛤仔脂肪相和孔隙水相之間的分配也達(dá)到平衡.
同時(shí)，當(dāng)自由溶解態(tài)的PAHs在PDMS相和孔隙水相之間分配達(dá)到平衡時(shí)，lgKPDMS(KPDMS=CPDMS/Cfree)與lgKow也成顯著線性相關(guān)(圖 1，y=x-0.691，R2=0.978，r=0.99，p<0.01).Porte等(1993)就貽貝、鯔魚及螃蟹對底泥相及水相中多氯聯(lián)苯富集的研究發(fā)現(xiàn)，對于鯔魚和螃蟹，底泥相暴露后的lgBAF與lgKow的斜率明顯大于水相暴露后lgBAF與lgKow的斜率，說明鯔魚及螃蟹在底泥暴露過程中，除了富集孔隙水中污染物，還攝取了部分顆粒結(jié)合態(tài)污染物;而貽貝在兩相暴露實(shí)驗(yàn)中的所獲得的lgBCF與lgKow的斜率相同，表明暴露于底泥中貽貝體內(nèi)的污染物主要來自孔隙水中的污染物.而本研究中l(wèi)gBAF與lgKow的線性斜率和lgKPDMS與lgKow的線性斜率相當(dāng)(圖 1)，表明菲律賓蛤仔與PDMS攝取底泥中PAHs的主要途徑類似.
圖1 lgKow與lgBAF和lgKPDMS的關(guān)系
3.2.2 菲律賓蛤仔與PDMS富集PAHs的相關(guān)性
為進(jìn)一步探討PDMS在復(fù)雜體系中模擬菲律賓蛤仔生物富集PAHs的準(zhǔn)確性，本研究測定了平衡時(shí)3個(gè)濃度梯度下PDMS中PAHs的濃度(CPDMS)與菲律賓蛤仔體內(nèi)PAHs的濃度(Cb，lip)，并對兩組濃度進(jìn)行了回歸及相關(guān)性分析(圖 2)，且通過定量計(jì)算得到Cb，lip約為CPDMS的1.0~1.5倍.該定量關(guān)系與其他研究者基于PDMS預(yù)測疏水性有機(jī)污染物(HOCs)在底棲無脊椎生物體內(nèi)富集的定量關(guān)系有所差異，如Leslie等(2002)用PDMS預(yù)測搖蚊對底泥中PAHs富集的研究中得出Cb，lip≈8CPDMS.這種差異與受試生物種類有密切關(guān)系，不同生物體內(nèi)脂肪含量不同，而脂肪含量是影響疏水性化學(xué)物質(zhì)生物富集的主要因素(Geyer et al., 1994)，生物體內(nèi)脂肪含量越大，生物富集程度越高.本研究中菲律賓蛤仔體內(nèi)的脂肪含量僅為0.51%，與其他生物相比，脂肪含量較低(如搖蚊體脂含量為0.96%，河蜆體脂含量為2.37%);另外，生物體內(nèi)PAHs的殘留濃度與污染物在生物體內(nèi)可能會發(fā)生脂類代謝和生物轉(zhuǎn)化有關(guān)，如PAHs中苯并[a]芘會在沙蠶屬幼蟲體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化(Mcelroy et al., 1989).本實(shí)驗(yàn)僅針對PAHs母體化合物開展研究，沒有將不同生物體內(nèi)脂類代謝和生物轉(zhuǎn)化考慮在內(nèi).盡管如此，lgCPDMS與lgCb，lip呈顯著性相關(guān)，意味著基于固相微萃取技術(shù)的模擬生物法可以用于海洋雙殼類底棲生物體內(nèi)PAHs母體化合物的殘留模擬，且考慮到成本、效率和大范圍推廣的因素，使用固相微萃取模擬海洋養(yǎng)殖區(qū)底泥污染物在底棲生物體內(nèi)的富集殘留和檢測較傳統(tǒng)方法優(yōu)勢明顯.
?圖2 lgCPDMS與lgCb，lip的關(guān)系
3.3 PDMS相與底泥相中PAHs濃度的相關(guān)性
上述討論表明，基于固相微萃取技術(shù)的模擬生物法不僅可以計(jì)算PAHs在底泥孔隙水中的Cfree，且與菲律賓蛤仔體內(nèi)生物富集濃度存在顯著的相關(guān)性，如果能進(jìn)一步建立和完善PDMS相與底泥相中PAHs濃度間相關(guān)關(guān)系，就可為基于固相微萃取的模擬生物法在養(yǎng)殖區(qū)域中的污染物的監(jiān)測應(yīng)用奠定基礎(chǔ).
為此，本研究進(jìn)行了3個(gè)濃度梯度下底泥中OC標(biāo)化的PAHs濃度(CS，OC)與PDMS中PAHs濃度(CPDMS)的相關(guān)性研究(圖 3)，結(jié)果表明，PDMS中PAHs的濃度同樣與底泥中PAHs的濃度(y=0.758x-2.365，R2=0.65，r=0.83，p<0.01)間具有顯著相關(guān)性，且這種相關(guān)關(guān)系使得傳統(tǒng)CS，OC的總量測定結(jié)果可用于底泥污染物生物有效性評價(jià)，這對底泥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及底泥暴露風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)具有重大意義.本文中兩者間的定量關(guān)系為CS，OC≈5CPDMS，與Li等(2013)得出的CS，OC≈2CPDMS稍有不同，但共同點(diǎn)是污染物在底泥中的分配高于PDMS.原因是進(jìn)入底泥中的污染物，分為快速解吸、慢速解吸和極慢速解吸3種存在狀態(tài)，甚至部分以不可逆解吸狀態(tài)存在，3種存在狀態(tài)下污染物的物理遷移能力、生物有效性及化學(xué)反應(yīng)活性具有差異(Liu et al., 2011)，CS，OC為有機(jī)溶劑提取的污染物總濃度，而生物有效部分主要指可快速解吸的污染物，以PDMS為材料的固相微萃取法對污染物的獲取或濃縮過程完全基于化合物從化學(xué)勢或逸度高處(即外界環(huán)境基質(zhì))向化學(xué)勢或逸度低處(即采樣介質(zhì)或吸附劑)的自動擴(kuò)散(陳珊，2011)，其富集的PAHs以容易解吸部分為主，且大量研究表明，生物有效的HOCs主要來源于容易解吸的部分(胡霞林，2009;Reichenberg et al., 2006).因此，根據(jù)CS，OC評價(jià)底泥污染可能會過高估計(jì)底泥暴露環(huán)境中PAHs對底棲生物的危害.此外，相關(guān)關(guān)系之間的這種差異與底泥特性也有密切關(guān)系，如底泥OC含量、粒度分布及OC種類(如黑碳和煤)等(Cornelissen et al., 2005)也對PAHs的分配起至關(guān)重要的作用，也是今后本課題組將繼續(xù)深入研究的內(nèi)容之一.盡管如此，CS，OC與CPDMS的顯著相關(guān)仍表明基于固相微萃取的模擬生物法可用于養(yǎng)殖區(qū)域底泥中PAHs的污染監(jiān)測.具體參見 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。
?圖3 lgCPDMS與lgCS，OC的關(guān)系
4 結(jié)論
1)以PDMS為材料的固相微萃取模擬生物法為準(zhǔn)確測定底泥孔隙水中PAHs的Cfree提供了替代方法，Cfree低于Cwater，且環(huán)數(shù)越高，差異越大.Cfree能更好地反映底泥孔隙水中PAHs的暴露水平，為固相微萃取技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).
2)菲律賓蛤仔對PAHs的富集系數(shù)及PDMS-水分配系數(shù)均與辛醇-水分配系數(shù)呈顯著線性相關(guān)，且兩者的斜率相當(dāng)，表明菲律賓蛤仔與PDMS攝取底泥中PAHs的途徑類似.
3)PDMS中PAHs濃度與菲律賓蛤仔體內(nèi)殘留PAHs及底泥中OC標(biāo)化的PAHs濃度之間均呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，定量關(guān)系分別為Cb，lip≈1.5CPDMS和CS，OC≈5CPDMS，表明基于固相微萃取的模擬生物法具有在養(yǎng)殖區(qū)域有機(jī)污染物監(jiān)測中應(yīng)用的潛力，但有機(jī)污染物在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和底泥性質(zhì)對監(jiān)測應(yīng)用的影響有待進(jìn)一步研究.
