1 引言

　　隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)及國務(wù)院審議通過《畜禽規(guī)模養(yǎng)殖污染防治條例(草案)》，畜禽養(yǎng)殖場污水的高效無害化處理日顯重要.采用沼氣池厭氧處理是當(dāng)前對(duì)畜禽養(yǎng)殖污水最常見的處理方式，但從沼氣池中排出的沼液中富含氮磷等營養(yǎng)素，直接排放到天然水體中仍然會(huì)引起水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化.將沼液直接歸田然后通過農(nóng)作物吸收是當(dāng)前沼液最主要的處理方式.然而在農(nóng)村城鎮(zhèn)化建設(shè)的背景下，沼液直接歸田也存在受季節(jié)影響、單位面積處理效率低、所需配套農(nóng)田面積大等問題.因此，仍需尋找高效的沼液安全利用途徑.

　　利用藻類的吸收、富集和降解作用，可有效對(duì)污水進(jìn)行處理.早在1957年，Oswald等提出利用藻類去除污水中氮磷的可行性，之后應(yīng)用微藻處理生活污水和工業(yè)污水的研究不斷深入.Tam和Wong證實(shí)了蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和柵藻(Scenedesmus sp.)在污水二級(jí)處理中具有良好的氮、磷的去除效果，經(jīng)7 d處理即可去除污水中2/3以上的氮磷.董俊德等研究表明小顫藻(Oscillatoria tenuis)和兩棲顫藻(O. amphibia)對(duì)污水的無機(jī)磷去除率高，而對(duì)硝態(tài)氮的處理能力較差;極大螺旋藻(Spirulina masima)則能去除較多的硝態(tài)氮.Mart?nez等研究了溫度和攪拌形式對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)在二級(jí)城市污水中的脫氮除磷能力，發(fā)現(xiàn)在25 ℃和磁攪拌的情況下，磷的最大去除效率可達(dá)98%，氨氮的去除率可達(dá)到100%.李川等發(fā)現(xiàn)固定化的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)對(duì)人工污水中NH+4-N的去除效率最好，而魚腥藻(Anabaena sp.)對(duì)NO-3-N的去除率高.劉林林等對(duì)15株微藻在豬場養(yǎng)殖污水中的氮磷凈化能力及其細(xì)胞營養(yǎng)分析后發(fā)現(xiàn)多棘柵藻(Scenedesmus spinosus)SHOU-F8是豬場養(yǎng)殖污水凈化耦合微藻生物柴油生產(chǎn)的合適藻株.上述研究表明，微藻對(duì)污水氮磷的凈化效果受藻種、培養(yǎng)條件及污水中氮磷的形態(tài)與濃度等因素影響.

　　利用微藻凈化豬場養(yǎng)殖污水的研究已見較多報(bào)道，但利用微藻凈化豬場養(yǎng)殖污水中的氮磷并耦合微藻高附加值產(chǎn)品生產(chǎn)的研究較少.狹形小樁藻(Characium angustum)是一種淡水綠藻，屬于綠球藻目(Chlorococcales)，小樁藻科(Characiaceae)，小樁藻屬(Characium)，廣泛分布于包括污水在內(nèi)的多種類型的水體中，但目前對(duì)這種微藻尚未見有應(yīng)用研究.本文在實(shí)驗(yàn)室條件下研究了狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水的凈化效果及其細(xì)胞營養(yǎng)組成特點(diǎn)，以期為狹形小樁藻后續(xù)在污水凈化中的應(yīng)用積累資料.

　　2 材料與方法

　　2.1 試驗(yàn)材料

　　試驗(yàn)用豬場養(yǎng)殖污水取自浙江嘉興余新鎮(zhèn)敦好農(nóng)牧有限公司的養(yǎng)豬場.養(yǎng)殖污水經(jīng)過沼氣池厭氧發(fā)酵及露天氧化塘沉淀處理后，用于本試驗(yàn).試驗(yàn)用原污水及其經(jīng)過高壓滅菌或有效氯消毒后的水質(zhì)指標(biāo)如表 1所示.

　　表1 試驗(yàn)用豬場養(yǎng)殖污水的水質(zhì)狀況

　　本試驗(yàn)所用狹形小樁藻取自上海海洋大學(xué)微藻種庫，藻種分離自一生活污水排污溝，采用f/2培養(yǎng)液逐級(jí)擴(kuò)培后用于本試驗(yàn).

　　2.2 試驗(yàn)方法 2.2.1 不同接種濃度下狹形小樁藻對(duì)高壓滅菌污水的處理效果

　　將預(yù)先擴(kuò)培的同一批次的狹形小樁藻，離心收集藻細(xì)胞，然后將收集的細(xì)胞分別接種到經(jīng)高壓滅菌的豬場養(yǎng)殖污水中.設(shè)定3個(gè)接種密度：200×104，400×104，600×104 cells · mL-1.實(shí)驗(yàn)在1 L的三角燒瓶中進(jìn)行，每個(gè)處理3個(gè)平行.微藻在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度27 ℃，光照1800 lx，光照周期24 h/0 h(L : D).每天定時(shí)搖瓶，隔天用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度并測(cè)定培養(yǎng)水體中氮、磷變化情況.試驗(yàn)持續(xù)23 d.試驗(yàn)結(jié)束時(shí)離心收集藻細(xì)胞，分析細(xì)胞蛋白含量及脂肪酸組成.

　　2.2.2 污水預(yù)處理方法對(duì)狹形小樁藻去除氮磷效果的影響

　　在不同接種濃度試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇600×104 cells · mL-1的接種濃度，比較狹形小樁藻在高壓滅菌的豬場養(yǎng)殖污水及有效氯消毒(200 ppm)并中和的豬場養(yǎng)殖污水中的生長及其對(duì)氮磷去除效果.其培養(yǎng)方法及檢測(cè)處理同2.2.1節(jié).

　　2.3 指標(biāo)檢測(cè)

　　用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定藻細(xì)胞密度，并根據(jù)公式K =(lnNt-lnN0)· t-1計(jì)算相對(duì)生長率，其中，N0為培養(yǎng)初始藻細(xì)胞密度(cells · mL-1)，Nt為培養(yǎng)t d后的藻細(xì)胞密度(cells · mL-1)，t為培養(yǎng)時(shí)間(d).

　　用0.45μm濾膜過濾藻液，然后參照水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第4版)測(cè)定濾液中氮磷水平.總氮測(cè)定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法;氨態(tài)氮測(cè)定采用納氏試劑分光光度法;硝態(tài)氮測(cè)定采用紫外分光光度法;總磷測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法.

　　氮磷去除率r的計(jì)算公式：

　　其中，C0和Ct分別為初始氮磷的濃度和培養(yǎng)t d后的濃度(mg · L-1).

　　藻細(xì)胞蛋白含量的測(cè)定參照福林-酚測(cè)蛋白法進(jìn)行;藻細(xì)胞脂肪酸含量的測(cè)定參照進(jìn)行;微藻脂肪酸甲酯的理論烷基值參照的方法進(jìn)行計(jì)算.

　　2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

　　結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用PASW.Statistics.18.0軟件進(jìn)行方差分析并作Duncan多重比較，p<0.05，表示差異顯著.

　　3 結(jié)果

　　3.1 不同處理組狹形小樁藻生長狀況

　　不同接種濃度下狹形小樁藻的生長如圖 1所示.在23 d的培養(yǎng)期間，200×104 cells · mL-1、400×104 cells · mL-1、600×104 cells · mL-1(滅菌)和600×104 cells · mL-1(消毒)組藻的相對(duì)生長率分別為0.120、0.104、0.092和0.097.經(jīng)方差分析可知，200×104 cells · mL-1組藻細(xì)胞相對(duì)生長率顯著高于其他組(p<0.05)，藻細(xì)胞密度由初始的210×104 cells · mL-1增長到3284×104 cells · mL-1.400×104 cells · mL-1組藻細(xì)胞相對(duì)生長率顯著高于600×104 cells · mL-1，其藻細(xì)胞密度由初始的419×104 cells · mL-1增長到4649×104 cells · mL-1.然而最終細(xì)胞培養(yǎng)密度以600×104 cells · mL-1(消毒)組最高，為5828×104 cells · mL-1，顯著高于其他組;600×104 cells · mL-1(滅菌)組次之，200×104 cells · mL-1組最終細(xì)胞培養(yǎng)密度最小.

　　圖 1 不同處理組狹形小樁藻在豬場養(yǎng)殖污水中的生長曲線

　　3.2 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中總氮的去除效果

　　由圖 2可以看出，600×104 cells · mL-1(消毒)組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水的總氮去除率最高，為90.05%，顯著高于其他各組(p<0.05)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)水體總氮含量為2.69 mg · L-1.400×104 cells · mL-1組和600×104 cells · mL-1(滅菌)組的總氮去除率分別為55.54%和64.32%.200×104 cells · mL-1組的去除率為41.68%，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)水體總氮含量為18.11 mg · L-1.可以看出，600×104 cells · mL-1(消毒)組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中的總氮去除效果最好.

　　圖 2 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中總氮的去除效果 (注：實(shí)線表示總氮去除率，虛線表示水體中總氮含量)

　　3.3 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮的去除效果

　　由圖 3以看出，各處理組的狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水的氨態(tài)氮的去除率均很高，在96%以上.經(jīng)23 d培養(yǎng)后，各處理組污水氨態(tài)氮的含量均降低為0.40 mg · L-1左右，符合地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn)，說明狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中的氨態(tài)氮有較好的去除效果.從圖 3還可知，600×104 cells · mL-1(消毒)組在接種第5天，水體氨態(tài)氮就達(dá)到了最大去除率，600×104 cells · mL-1(滅菌)組在第15天達(dá)到最大去除率，400×104 cells · mL-1組在第19天達(dá)到最大去除率，而200×104 cells · mL-1組在第23天達(dá)到最大去除率.表明污水中氨態(tài)氮的去除速率與狹形小樁藻的接種密度呈正相關(guān).

　　圖 3 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮的去除效果 (注：實(shí)線表示氨氮去除率，虛線表示水體中氨氮含量)

　　3.4 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中硝態(tài)氮的去除效果

　　600×104 cells · mL-1(消毒)組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水硝態(tài)氮去除率最高，為98.20%，顯著高于其他3組(p<0.05)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)水體中硝態(tài)氮的含量僅為0.31 mg · L-1.200×104 cells · mL-1組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中的硝態(tài)氮的處理效果最差，去除率僅為3.98%，水中硝態(tài)氮的殘留量仍然達(dá)到14.22 mg · L-1(圖 4).

　　圖 4 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中硝態(tài)氮的去除效果 (注：實(shí)線表示硝氮去除率，虛線表示水體中硝氮含量)

　　3.5 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除效果

　　不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水的總磷去除率都很高，均在90%以上(圖 5).試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，400×104 cells · mL-1組、600×104 cells · mL-1(滅菌)組和600×104 cells · mL-1(消毒)組水體中總磷含量降到0.1 mg · L-1左右，符合地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn)，200×104 cells · mL-1組總磷含量降到0.18 mg · L-1，也達(dá)到地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅲ類水標(biāo)準(zhǔn).

　　圖 5 不同處理組狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除效果 (注：實(shí)線表示總磷去除率，虛線表示水體中總磷含量)

　　3.6 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻藻細(xì)胞蛋白含量

　　利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的各組狹形小樁藻的細(xì)胞蛋白含量無顯著差異(p>0.05)，600×104 cells · mL-1(消毒)組藻細(xì)胞蛋白含量稍低，為30.94%(表 2).

　　表2 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻的細(xì)胞蛋白含量(干重)

　　3.7 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻藻細(xì)胞脂肪酸組成

　　由表 3可以看出，16 : 0、16 : 4n3、18 : 1n9、18 : 3n3和18 : 4n3是狹形小樁藻的主要脂肪酸，尤其是亞麻酸(18 : 3n3)含量，在25.65%~31.13%之間.各處理組狹形小樁藻藻細(xì)胞中多不飽和脂肪酸(PUFA)含量均很高，在50%以上.在相同接種密度下，與高壓滅菌組污水相比，經(jīng)有效氯消毒污水培養(yǎng)的藻細(xì)胞中飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)含量增加，PUFA含量減少.根據(jù)其脂肪酸組成，各組狹形小樁藻脂肪酸甲酯的理論烷基值CN介于44.72~47.06之間.

　　表3 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻藻細(xì)胞脂肪酸含量

　　4 討論

　　本研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)高壓滅菌的污水中，狹形小樁藻的生長性能隨著藻細(xì)胞接種密度的升高而降低，但對(duì)污水中氮磷的去除率隨藻細(xì)胞接種密度的升高而升高，接種密度為600×104 cells · mL-1時(shí)對(duì)污水中總氮總磷的去除率較兩個(gè)低接種密度組高，這與許多學(xué)者研究的高接種密度的藻細(xì)胞去除氮磷營養(yǎng)物效率較低密度組好是一致的報(bào)道利用不同接種濃度的蛋白核小球藻和柵藻對(duì)沉淀的污水和活性污水進(jìn)行處理，結(jié)果表明高接種密度的微藻對(duì)污水處理效果比低接種密度的好，在3 d內(nèi)對(duì)沉淀的污水的氨氮去除率分別達(dá)到91.5%和96.5%.這為以后處理豬場養(yǎng)殖污水提高微藻接種密度來提高對(duì)污水的凈化效率提供了有力依據(jù).

　　3種不同接種密度的狹形小樁藻對(duì)高壓滅菌污水的氨態(tài)氮去除率都較高，說明狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水的氨態(tài)氮有較好的利用率.Ip等研究表明氨氮濃度超過50 mg · L-1會(huì)抑制藻細(xì)胞的生長，本研究中氨氮濃度14 mg · L-1左右，沒有超過這個(gè)范圍，因此可以滿足藻細(xì)胞生長.經(jīng)過狹形小樁藻的處理，3組污水中的氨態(tài)氮濃度均降低到0.5 mg · L-1以下，達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ類標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002).從對(duì)氨態(tài)氮去除的時(shí)間來看，接種密度為600×104 cells · mL-1的藻細(xì)胞在第15天就將氨態(tài)氮降低到最低水平(0.34 mg · L-1)，接種密度為400×104 cells · mL-1的藻細(xì)胞在第19天將氨態(tài)氮降低到較低水平(0.60 mg · L-1)，說明了藻細(xì)胞接種密度越大，達(dá)到最大去除率的時(shí)間越短，進(jìn)而說明提高微藻接種密度可提高對(duì)污水的凈化效率.Lau等對(duì)不同接種濃度下小球藻對(duì)初級(jí)城市污水的處理結(jié)果也表明，高接種濃度能提高小球藻對(duì)污水的凈化速度.

　　本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮濃度降到較低水平后，狹形小樁藻對(duì)污水中硝態(tài)氮的去除效果才有明顯提高(圖 3，圖 4).表明所用的狹形小樁藻優(yōu)先利用水體中的氨態(tài)氮，當(dāng)氨態(tài)氮耗盡或降低至一極低水平時(shí)，才開始利用水體中硝態(tài)氮，這與Przytocka等研究結(jié)果是一致的.不同接種濃度下狹形小樁藻對(duì)豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除率都很高，去除率均在90%以上，經(jīng)微藻處理后的養(yǎng)殖污水中總磷的水平均降低到0.2 mg · L-1以下，達(dá)到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ-Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002).

　　本研究中所用的豬場養(yǎng)殖污水采用高壓滅菌和有效氯消毒(再用硫代硫酸鈉中和)兩種預(yù)處理方式.兩種預(yù)處理方式均對(duì)污水中的氮形態(tài)和水平產(chǎn)生一定變化.與原污水相比，經(jīng)高壓滅菌污水的總氮由35.5 mg · L-1降低為31.0 mg · L-1，氨態(tài)氮濃度由17.0 mg · L-1降至14.0 mg · L-1，而硝態(tài)氮濃度由14.0 mg · L-1升至15.0 mg · L-1.說明高壓滅菌過程中污水中的部分氨態(tài)氮有逸出，另有少部分轉(zhuǎn)變成硝態(tài)氮.而經(jīng)有效氯處理后的污水，總氮由35.5 mg · L-1降低為27.1 mg · L-1，氨態(tài)氮濃度由17.0 mg · L-1大幅下降9.4 mg · L-1，硝態(tài)氮濃度由14.0 mg · L-1升至17.2 mg · L-1.說明經(jīng)過次氯酸鈉處理后污水中有較多的氨態(tài)氮逸出或轉(zhuǎn)化成了硝態(tài)氮，這與有效氯的強(qiáng)氧化性及高pH有關(guān).

　　在相同的接種濃度600×104 cells · mL-1下，有效氯消毒組狹形小樁藻的生長及其對(duì)豬場養(yǎng)殖污水的凈化效果均比高壓滅菌組好，對(duì)豬場養(yǎng)殖污水的總氮和硝態(tài)氮去除率分別為90.05%和98.19%，顯著高于高壓滅菌組.這一方面可能與高壓滅菌處理的污水中總氮及氨態(tài)氮水平較有效氯消毒處理組高有關(guān)，另一方面也與微藻生長所需的某些生理活性物質(zhì)經(jīng)高壓滅菌后遭到破壞有關(guān).

　　本研究發(fā)現(xiàn)利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻的蛋白含量與接種密度無顯著相關(guān)性，表明試驗(yàn)條件下接種密度不影響?zhàn)B殖狹形小樁藻的蛋白含量，各處理組藻細(xì)胞蛋白含量均在30%以上，達(dá)到蛋白源飼料標(biāo)準(zhǔn).由狹形小樁藻的脂肪酸組成分析可知，其藻細(xì)胞中含有豐富的亞麻酸(18 : 3n3)(表 3).王銘等研究表明，綠藻類的四列藻和小球藻的亞麻酸含量分別占總脂肪酸含量的19.70%和24.95%，而8種金藻門及硅藻門的種類亞麻酸含量均很低.蔣霞敏和鄭亦周研究發(fā)現(xiàn)小球藻、亞心形扁藻和鹽藻的亞麻酸含量分別占總脂肪酸含量的30.13%、25.57%和30.07%.亞麻酸是陸生動(dòng)物及淡水魚類的必需脂肪酸，這是因?yàn)榈~類缺乏將油酸(18 : 1n9)轉(zhuǎn)化為亞麻酸所必須的Δ15 去飽和酶.淡水魚飼料中缺乏亞麻酸，將會(huì)降低其生長速度及抗感染脅迫的能力.由于狹形小樁藻細(xì)胞中含有豐富的PUFA，導(dǎo)致其脂肪酸甲酯的理論烷基值都較低.根據(jù)美國生物柴油標(biāo)準(zhǔn)，生物柴油烷基值最低不得低于47.因此，利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻不適合作為微藻生物柴油的原料，但可以作為水產(chǎn)動(dòng)物的飼料蛋白源或飼料添加劑.具體參見 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　5 結(jié)論

　　狹形小樁藻能在豬場養(yǎng)殖污水中生長，高的接種密度有利于對(duì)污水中氮磷的凈化，且狹形小樁藻優(yōu)先利用豬場養(yǎng)殖污水中的氨態(tài)氮后利用硝態(tài)氮.因此，可利用狹形小樁藻凈化豬場養(yǎng)殖污水并耦合生產(chǎn)富含亞麻酸等n-3系列多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)的飼料添加劑或飼料蛋白源.