腈綸,又稱聚丙烯腈纖維,是一種重要的石油化工產品,由于具有耐光、抗菌、保暖性好等優點,廣泛應用于服裝加工、 裝飾品生產和新材料的制備等領域[1].目前,國內腈綸廠多采用以丙烯腈原料的干法或濕法工藝生產腈綸產品,其廢水主要為腈綸聚合廢水和丙烯腈廢水.其中,腈綸聚合廢水污染物濃度高、 水質成分復雜,并且含有大量的無機鹽、 難降解有機物和高分子聚合物,處理難度大[2].相比而言,丙烯腈廢水污染負荷較低,廢水可生物降解性較好.國內腈綸廠多采用將兩種廢水混合后再進行A/O生化處理的方法,但由于廢水中難生物降解有機物較多,導致工藝處理出水COD和NH+4-N濃度遠超出國家規定的排放標準[3,4].

　　目前,對腈綸廢水的研究主要集中在強化預處理和深度處理等方面[5,6,7].研究表明,采用高級氧化技術對腈綸聚合廢水進行分質強化預處理可以獲得較好的處理效果[8,9],以Fenton氧化預處理干法腈綸聚合廢水為例,處理后廢水COD可由1200 mg ·L-1降至600 mg ·L-1左右,污染負荷和生物毒性大幅降低,廢水可生化性明顯提高[10].物化預處理雖然可以改善廢水的水質和可生物降解性,但處理后的出水仍需進一步的生化處理,以實現廢水的達標排放或回用.此外,腈綸廢水中高濃度有機氮和氨氮的去除也需要由生化處理過程來完成,這就要求生化處理工藝必須具有較高的脫氮效能.序批式膜生物反應器(sequencing batch membrane bioreactor,SBMBR)是序批式生物反應器與膜分離技術的有機結合[11],不但具有傳統SBR工藝簡單、 運行維護方便、 抗沖擊負荷能力強等優點,而且膜的高效截留作用使反應器維持較高的污泥濃度,能有效提高氮、 磷和有機物的去除效果,具有良好的出水水質[12,13,14,15].

　　本研究以Fenton氧化預處理后的腈綸聚合廢水和丙烯腈廢水為研究對象,考察了SBMBR對廢水的處理效能,優化了工藝運行條件,并采用PCR-DGGE及克隆技術分析了不同運行階段反應器內微生物群落結構的動態變化,確定了反應器運行過程中的主導微生物,以期為進一步提高腈綸廢水的生化處理效能提供理論參考依據. 1 材料與方法 1.1 試驗用水

　　試驗所用的腈綸聚合廢水和丙烯腈廢水取自東北某石化廠,首先將聚合廢水采用Fenton氧化預處理[10],處理后廢水平均COD由1091 mg ·L-1降至560 mg ·L-1,BOD5/COD由0.32升高至0.69,然后將預處理后的聚合廢水按1 ∶1的比例與丙烯腈廢水混合,混合后廢水COD為450~600 mg ·L-1,HN+4-N為50~80 mg ·L-1,TN為140~200 mg ·L-1, pH值6.5~8.0.模擬丙烯腈廢水采用葡萄糖、 硫酸銨等配制,同時加入適量的微量元素液,其COD為340~470 mg ·L-1,HN+4-N為30~60 mg ·L-1.

　　1.2 試驗裝置與運行條件

　　SBMBR反應器有效容積為30 L,內置3片聚偏氟乙烯平板膜元件(SINAP-10-PVDF),單片有效膜面積為0.1 m2,膜孔徑0.1 μm.反應器采用周期運行的方式,通過間歇曝氣實現缺氧/好氧的交替運行,曝氣量為600 L ·h-1.反應器在進入缺氧階段后的前5 min內完成進水,在好氧階段的最后60 min時采用間歇式抽吸出水(抽10 min/停2 min)的方式排水,每個周期出水5.0 L,體積交換比為1 ∶6. SBMBR的運行采用可編程邏輯控制器(programmable logic controller,PLC)自動控制系統來實現,反應器內溫度控制在30℃±1℃.接種污泥取自北京某污水處理廠二沉池回流污泥,初始活性污泥濃度約為3000 mg ·L-1.試驗裝置如圖 1所示.

　　圖 1 試驗裝置示意

　　反應器采用逐漸增加實際廢水比例的方式運行,根據運行條件和進水水質的不同,整個運行期可以分為9個階段,各階段污泥樣品分別標記為S1~S9.反應器的運行條件見表 1.

　　表 1 SBMBR不同階段的運行條件

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 生化指標

　　COD、 NH+4-N、 NO-3-N、 TN均采用標準方法測定[16]; pH值采用pH計(OHAUS Starter 3C,美國奧豪斯)測定. 1.3.2 PCR-DGGE

　　采用離心式DNA快速提取試劑盒(Qiagen，美國)提取細菌的總DNA,采用細菌通用引物8F-GC、 518R對總細菌16S rDNA進行PCR擴增.PCR反應采用50.0 μL的反應體系,其組分包括：5.0 μL的10×PCR buffer,4.0 μL的dNTP Mixture(各2.5 mmol ·L-1),1.0 μL的引物338F(20.0 μmol ·L-1),1.0 μL的引物534R(20.0 μmol ·L-1),0.25 μL的TaKaRa rTaq(5 U ·μL-1),以及2.5 ng的DNA模板.PCR反應條件如下：94℃預變性10.0 min,94℃變性1.0 min,55℃退火1.0 min,72℃延伸1.5 min(每個循環溫度降低0.1℃),共循環30次,最后在72℃條件下延伸10.0 min. DGGE在D-code系統(Bio-Rad，美國)上進行,聚丙烯酰胺凝膠濃度為8.0%,變性劑濃度梯度范圍為30.0%~60.0%,電泳電壓為150 V,溫度為60℃,在1×TAE緩沖溶液中電泳420 min,然后采用硝酸銀進行染色,利用凝膠成像系統(Bio-Rad，Gel-Doc XR,美國)進行觀察、 拍照. 1.3.3 克隆測序

　　選擇DGGE膠板上含有目的DNA的條帶,用滅菌后的手術刀切下并迅速轉移至離心管中,用滅菌后的刀片將膠塊壓碎,加入30.0 μL ddH2O在4℃條件下溶解24 h,在5000 r ·min-1轉速下離心5.0 min,取5.0 μL上清液為模板,采用總細菌引物8F-GC和518R進行PCR擴增.擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳,檢測回收產物,用QIAquick PCR純化試劑盒對擴增產物進行純化,并送至北京寶杰羅生物工程公司進行16S rDNA片段序列測定. 1.3.4 DGGE圖譜統計分析

　　采用Shannon-wiener多樣性指數H′表征微生物種群多樣性,其計算公式如下[17]：

　　式中,Pi=ni/N; ni為第i個條帶的強度; N為所有條帶強度總和. 2 結果與討論 2.1 膜生物反應器處理效果 2.1.1 連續運行效果

　　SBMBR不同運行階段對COD、 NH+4-N和TN的去除效果見表 2.在反應器的啟動階段(Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ和 Ⅳ),隨著聚合廢水比例(10%、 20%、 40%和50%)的逐漸增加,COD平均去除率由第I階段的95.5%降低到第Ⅳ階段的87.2%,NH+4-N和TN的平均去除率由第Ⅰ階段的95.9%、 72.7%分別降至48.8%、 60.0%.NH+4-N出水平均濃度由0.8 mg ·L-1升至17.5 mg ·L-1,這主要是由于廢水中的堿度不足,導致硝化反應產生大量的酸,SBMBR反應器內混合液pH值降至6.0以下,使得硝化細菌的活性受到抑制,導致出水NH+4-N濃度升高[18,19].在第Ⅴ和Ⅵ階段,SBMBR進水仍采用1 ∶1的聚合廢水和模擬丙烯腈廢水,并向進水中投加0.5 g ·L-1的碳酸氫鈉以增加廢水的堿度.由表 2可以看出,在第Ⅵ階段,進水NH+4-N的濃度升至65.3 mg ·L-1,但出水NH+4-N濃度卻降至0.9 mg ·L-1左右,NH+4-N平均去除率迅速升高至98.6%,此時COD的去除率仍然保持在86.0%左右.這說明在SBMBR處理腈綸廢水的過程中,堿度是限制NH+4-N硝化的最主要的影響因素之一. 從第89 d開始,SBMBR進水完全采用實際廢水,聚合廢水與丙烯腈廢水的比例為1 ∶1.在第Ⅶ階段,反應器進出水COD平均濃度分別為450.3 mg ·L-1和129.2 mg ·L-1,COD平均去除率由86.3%降至71.1%,但NH+4-N去除率仍保持在97.5%以上.這說明在丙烯腈廢水中存在部分難生物降解有機物,導致出水COD略有升高,但SBMBR仍然保持較高的NH+4-N去除效率.根據周期試驗的優化結果,從第99d開始,調整每個運行周期內厭氧好氧的時間為90 min和150 min.在第Ⅷ階段,出水COD和NH+4-N的平均濃度分別為117.3 mg ·L-1和1.7 mg ·L-1,平均去除率分別為71.7%和98.0%,但TN的平均去除率僅為47.4%,這主要是由于進水C/N比過低、 微生物缺乏足夠的碳源導致的.在第Ⅸ階段,往進水中投加葡萄糖增加碳源,進水COD濃度增加至598.2 mg ·L-1,而出水COD濃度則降至105.1 mg ·L-1,NH+4-N濃度則降至1.0 mg ·L-1以下,COD、 NH+4-N和TN的平均去除率分別為82.5%、 98.7%和74.6%,出水指標可以達到國家一級排放標準.

　　表 2 SBMBR在不同運行階段的主要參數

　　同傳統的活性污泥處理工藝相比,SBMBR系統對廢水COD的去除率更高,這主要歸于以下兩個原因：一方面,長期的厭氧/好氧交替環境馴化出適應腈綸廢水特性的微生物種群,這些微生物能夠有效利用廢水中的有機污染物[20]; 另一方面,SBMBR系統膜分離及膜表面的泥餅有很強的過濾分離能力,能有效濾除廢水中懸浮物、 大分子有機物和微生物體[21,22],保證了SBMBR系統優良且穩定的出水水質.此外,反應器運行期間平板式膜組件表現出較強的抗污染能力,在膜通量為16.7 L ·(m2 ·h)-1,MLSS在6000~6500 mg ·L-1之間,曝氣量為10.0 L ·min-1的運行條件下,前60 d跨膜壓差(transmembrane pressure,TMP)基本上保持在7.5 kPa左右,此后開始逐漸升高,第87 d的時候TMP達到27.0 kPa,超過了25.0 kPa的清洗臨界值,取出膜組件采用物理清洗后TMP恢復至8.0 kPa左右,在之后運行的40 d時間里,TMP沒有出現明顯的升高. 2.1.2 周期試驗

　　序批式生物反應器通過間歇曝氣的方式在反應器運行中實現缺氧/好氧的交替循環,最終通過硝化/反硝化過程實現有機物和氮的去除,因此,合理的運行周期不僅可以提高生化系統的處理效果,還能降低能耗和運行成本[23].在反應器運行的Ⅰ到Ⅶ階段,SBMBR的周期運行方式為60 min缺氧/300 min好氧,該條件下單個運行周期內COD、 NH+4-N、 NO-3-N的變化如圖 2(a)所示,可以看出,COD的降解和NO-3-N的去除主要發生的缺氧攪拌期(0~60 min),這是因為在缺氧條件下,異養型的反硝化細菌以廢水中有機物為營養物質,通過反硝化過程實現N的去除[24].此外,在缺氧攪拌過程中,系統中NH+4-N的濃度逐漸升高,這主要是廢水中有機氮在微生物作用下向NH+4-N轉化導致的.在好氧階段(60~360 min),經過約90 min的曝氣,NH+4-N濃度迅速降低至1.0 mg ·L-1左右,NO-3-N的濃度逐漸升高并在在曝氣210 min左右時基本達到最大并穩定.為了提高反應系統對污染物的降解能力,減少過度曝氣帶來的能耗損失,從第99 d開始,調整SBMBR的運行周期為90 min缺氧/150 min好氧,由圖 2(b)可以看出,在該運行條件下,COD和NH+4-N都能夠在最經濟的條件下得到有效的去除,出水可以穩定達標排放.

　　圖 2 COD、NH4+-N和NO3--N濃度在周期試驗中的變化

　　2.2 微生物群落結構分析

　　2.2.1 總細菌的DGGE圖譜

　　反應器運行各階段污泥樣品總細菌的DGGE指紋圖譜見圖 3.從中可以看出,在反應器連續運行的9個階段,各階段污泥樣品的電泳條帶數目、 條帶強度和條帶遷移速率均存在一定的差異,SBMBR系統中微生物種群呈現出較為明顯的演替變化.在反應器運行的初始階段(Ⅰ和Ⅱ),污泥的培養馴化還未完成,污泥樣品的條帶數目較少,說明微生物種群結構較為簡單.隨著實際廢水比例的不斷增加和污泥的馴化,污泥樣品的條帶數目開始逐漸增多,條帶分布也較為均勻,說明微生物種群組成開始變得更加豐富,反應器的穩定性也在不斷增強.從S7開始,由于采用了實際丙烯腈廢水代替之前的模擬廢水,進水水質發生了明顯的變化,微生物種群結構也發生了較為明顯的變化,部分菌種(如18和20)的條帶強度略有降低,并產生了一些新的條帶(如7、 14和19),說明不適應進水水質的微生物群落優勢度降低,降解實際廢水中污染物的新菌群逐步建立并形成為優勢菌種.S9樣品泳道中條帶較為豐富、 均勻度較好,說明反應器經過一個階段的運行后,微生物群落逐漸豐富并達到一個穩定的狀態.

　　圖 3 SBMBR污泥總細菌的DGGE指紋圖譜

　　采用非加權配對算術平均法(UPGMA)對微生物群落結構相似性作聚類分析,結果如圖 4所示.從中可以看出,9個樣品的微生物群落可以分成3大族群,樣品1、 2為一個族群,樣品3、 4、 5為一個族群,樣品6、 7、 8、 9為一個較大的族群,這說明隨著反應器運行條件的不同和進水水質的變化,污泥微生物群落結構發生了一定程度的變化.在完全采用實際廢水處理后,污泥樣品的群落結構與之前采用部分模擬廢水時的群落結構存在較為明顯的變化.

　　圖 4 SBMBR中細菌群落結構的聚類分析

　　2.2.2 總細菌多樣性指數

　　采用Shannon-wiener多樣性指數表征總細菌群落結構多樣性,結果見圖 5.在S1~S4,隨著聚合廢水比例的逐漸增加,在廢水特征污染物的選擇作用下,一些不適應聚合廢水的微生物生長處于劣勢,微生物種群數量減少,生物多樣性指數略有下降,而隨著新的微生物種群結構的建立和微生物對水質和外部環境的逐漸適應,細菌種類和數量又開始增加,生物多樣性指數上升,在S4時達到了一個較高的水平.從S5開始,由于調整了進水堿度和pH,微生物群落結構受到外部環境變化影響,微生物多樣性指數出現小幅降低,而在之后的一段時間內(S5~S9),反應器pH值始終維持在7.5~8.5之間,進水的水質也基本趨于穩定,微生物的生長條件比較適宜,新的微生物種群結構逐漸建立,S9的微生物的多樣性指數達到了最大.

　　圖 5 SBMBR微生物多樣性指數

　　2.2.3 優勢菌種的鑒定

　　對DGGE指紋圖譜的條帶進行回收測序分析,將測序結果與NCBI(National Center for Biotechnology Information,USA)數據庫中已知序列進行比對,確定各微生物的同源性及種屬,檢測到的微生物及其相關信息如表 3所示.經比對鑒定,在SBMBR的9個污泥樣品中共檢測到22種微生物,其相似度大多在98%以上,其中屬于變形菌Proteobacterium的微生物有12種,分別屬于α綱(5種)和γ綱(7種),其余10種屬于未分類的Bacterium.

　　在反應器運行不同階段,DGGE指紋圖譜中的條帶強度和優勢菌種也在不斷變化,各菌種的功能也不盡相同.Uncultured bacterium clone S2-42(條帶7)和Uncultured bacterium clone AS_bH9(條帶14)主要與氨氮的硝化過程有關[25]; Klebsiella pneumoniae strain 27F(條帶8)主要與醇類物質的降解過程有關[26]; Uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium(條帶15)檢出于受石油污染的土壤,與甲苯的降解過程有密切的關系[27].另外,根據GenBank數據庫描述,Sphingomonas sp. EMBS051(條帶10)發現于染料廢水的生物降解過程中,與廢水中大分子芳香族化合物的降解過程有關; Uncultured bacterium clone PAE-49(條帶18)與氨氮的硝化過程有關; Uncultured bacterium clone WT14H7(條帶19)和Uncultured bacterium clone WT14H9(條帶20)發現于吡啶的堆肥降解過程中,可能與腈綸廢水中某些類似含氮雜環有機物的降解過程有關.

?　　

表 3 SBMBR中優勢菌條帶測序結果

　　在處理實際腈綸廢水的最后3個階段,反應器內優勢微生物主要有：Uncultured bacterium clone F49 (FJ230895.1)、 Uncultured bacterium clone S2-42 (JF503089.1)、 Sphingomonas sp. EMBS051 (JX233782.1)、 Uncultured bacterium clone AS_bH9 (JQ413643.1)、 Uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium (EU266796.1)、 Uncultured bacterium clone PAE-49 (JX875908.1)、 Uncultured bacterium clone WT14H7 (JX283544.1),這7種微生物在降解腈綸廢水污染物的過程中起著重要作用,是保證生化處理單元效果和反應器穩定運行的重要保證.然而,這些微生物多為未培養的微生物,且腈綸廢水的污染物組成十分復雜,要具體了解這些微生物在反應器中的功能,以及它們與特定污染物降解之間的關系,還需要做更細致、 更深入的研究. 具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。

　　3 結論

　　(1)SBMBR處理Fenton預處理后的腈綸聚合廢水和丙烯腈廢水,在廢水比例為1 ∶1、 HRT為24 h、 缺氧90 min/好氧150 min交替運行條件下,出水COD和NH+4-N濃度分別為105 mg ·L-1和0.9 mg ·L-1,出水水質可以穩定達到國家污水綜合排放標準(GB 8978-1996)的一級標準.

　　(2)堿度和碳源不足是限制脫氮效能的主要影響因素,堿度不足影響NH+4-N的硝化反應,碳源不足影響TN的去除效果,增加進水碳源可以顯著提高TN的去除效率.

　　(3)PCR-DGGE分析表明,反應器內微生物多樣性與進水水質和運行條件密切相關,反應器運行期間微生物群落結構呈現出明顯的演替過程,生化系統完全穩定后,微生物多樣性指數達到最大.

　　(4)通過克隆測序，從9個運行階段的污泥樣品中成功鑒定獲得22種微生物的16S rDNA序列,并篩選出7種降解腈綸廢水的優勢微生物,為腈綸廢水生化處理的深入研究提供了分子生物學基礎資料.(來源及作者：中國環境科學研究院環境基準與風險評估國家重點實驗室 魏健、宋永會、趙樂)