膜過濾處理工藝因其出水濁度低、處理效率高等優(yōu)勢在污水處理中有著廣泛應用.但膜污染成為限制其長久運行的主要問題，其中膜表面生物膜形成導致的生物污染占據(jù)重要原因[2].目前膜污染防治的方法主要有: ①膜表面改性等物理法;②利用強酸、強堿、氧化劑進行清洗等化學法;③酶干擾及群體感應抑制法等生物法.物理法和化學法換膜成本高、風險大，且易造成抗性菌株的產(chǎn)生及新的環(huán)境與健康危害.生物法的出現(xiàn)為從根本上防止及控制生物淤積提供了一條可能的途徑，由于其環(huán)境友好，安全性高及可持續(xù)性等優(yōu)勢在近年來迅速崛起，成為近期膜污染研究的熱點.

　　群體感應淬滅法是指通過抑制細菌之間的信號交流(群體感應，quorum sensing，QS)來控制細菌生物膜形成的方法.在群體感應調(diào)控的生物膜形成過程中，AHL類自誘導物(N-酰基高絲氨酸環(huán)內(nèi)酯，N-acyl homoserine lactone，AHLs)是一種非常重要的信號分子.近年來，基于群體感應淬滅理論(quorum quenching，QQ)控制膜污染的生物法受到廣泛關注. Oh等嘗試將能分解AHLs的重組大腸桿菌封裝入中空纖維膜的微孔中，有效控制了生物淤積. Kim等從MBR活性污泥及膜表面泥餅層中分離出紅球?qū)倬?Rhodococcus sp. BH4)，通過制成細胞包埋珠有效驗證了其群體感應淬滅效應.

　　然而，目前應用于膜污染防治的群體感應淬滅菌只有為數(shù)幾株且分解信號分子AHLs的種類有限，在不同污水環(huán)境中，對膜污染的防治效果仍處于探索階段.更多用于膜污染防治的群體感應淬滅菌仍待進一步分離.本研究從實際污水處理廠活性污泥中分離純化出1株群體淬滅功能菌株蠟樣芽孢桿菌HG10，該種菌在土壤、生活污水和垃圾滲濾液等環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)且已被證實具有群體感應淬滅功能.但目前關于該菌在防止膜污染方面的研究尚未見報道;基于此，本實驗通過對菌株HG10進行包埋固定，驗證其群體感應淬滅功能在控制生物膜形成方面的可行性及效果，以期為該種菌在膜污染防治中應用提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù).

　　1 材料與方法

???????1.1 材料

?????? 1.1.1 樣品來源

　　用于菌株分離的活性污泥樣取自深圳某污水處理廠.

　　1.1.2 LB培養(yǎng)基

　　蛋白胨10 g、酵母膏粉5 g、氯化鈉5 g、葡萄糖1 g;蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆?固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%. 1/2 LB培養(yǎng)基的各成分含量為上述0.5倍.

　　1.1.3 試劑及菌株

　　N-乙酰高絲氨酸環(huán)內(nèi)酯(C6-HSL)和N-癸酰高絲氨酸環(huán)內(nèi)酯(C10-HSL)均購于Cayman Chemical (USA);PCR反應所用Premix Taq混合酶購于TaKaRa (Japan);包埋菌株所用載體為海藻酸鈉(aladdin，AR);實驗所用微濾膜為Millipore微孔過濾膜(GVWP04700，0.22 μm，47 mm);報告菌Chromobacterium violaceum CV026和Chromobacterium violaceum VIR07為實驗室保存;人工配置污水配方如表 1.

　　　表 1 合成污水配方

　　1.2 菌株分離純化

　　采用基本培養(yǎng)基法定向分離具有QQ功能的細菌，配置C6-HSL (2.5 mmol ·L-1)為唯一碳源的基本培養(yǎng)基，將污泥2 μL接種于100 μL基本培養(yǎng)基中，恒溫振蕩(700 r ·min-1，30℃)培養(yǎng)3 d后，取1 μL接種到新的C6-HSL為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中，將連續(xù)3次富集培養(yǎng)后的菌液涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)，于培養(yǎng)24 h、48 h時挑取不同形態(tài)單菌落進行分離純化.對所有分離菌落進行QQ功能檢測.

　　1.3 分離菌株QQ和QS功能檢測

　　使用報告菌CV026對分離菌株進行QQ功能檢測:滴加的樣品中含有C6-HSL時，含有報告株CV026的LB培養(yǎng)基上呈現(xiàn)紫色反應.將分離菌株于1/2 LB培養(yǎng)基前培養(yǎng)12 h后，取菌液以1 :100體積比轉(zhuǎn)接到新的1/2 LB培養(yǎng)基中(其中含有濃度為10 μmol ·L-1的C6-HSL溶液);在30℃，170 r ·min-1條件下培養(yǎng)8、10、12、24 h時，取菌液500 μL并離心(13 500 r ·min-1, 5 min)，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后-20℃凍存;將無菌濾紙片放置于含有CV026的LB平板上，在濾紙片上滴加凍存濾液20 μL后，將LB平板恒溫30℃培養(yǎng)24 h，觀察濾紙周圍顯色反應.

　　分離細菌的QS功能檢測，使用CV026和VIR07為報告菌，分別對短鏈類AHLs (C4-C8)和長鏈類AHLs (C10-C16)進行驗證.將分離純化的QQ菌株菌落與報告菌CV026和VIR07以“T”型劃線的方式接種于同一LB平板，恒溫(30℃)培養(yǎng)24 h后觀察報告菌顯色反應. 10 μL的C6-HSL和C10-HSL (10 μmol ·L-1)分別被劃線在指示菌平板上，作為對照.

　　1.4 QQ菌株16S rRNA基因序列測定

　　使用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)和1492R (5′-GGCTACCTTGTTACGAC TT-3′)進行目的基因片段擴增.擴增條件: 94℃預變性3 min，94℃變性1 min，54℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35次循環(huán)，最后72℃延伸10 min.將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后由華大公司進行基因測序，測定序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫比對鑒定.

　　1.5 菌株固定化及QQ功能驗證

　　菌株HG10與質(zhì)量-體積濃度為4%的海藻酸鈉溶液(SA)按100 mg ·mL-1比例混勻后，滴加到質(zhì)量-體積濃度為3%的CaCl2溶液中，4℃交聯(lián)后低溫保存.制備無細菌包埋的空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)為對照組，以探究包埋珠對群體感應信號分子的物理吸附作用.

　　配置C6-HSL濃度為10 μmol ·L-1的LB培養(yǎng)基20 mL，設置3組實驗:加入8顆海藻酸鈉細菌包埋珠(SA-HG10)的培養(yǎng)基，加入8顆無細菌包埋的空海藻酸鈉珠的培養(yǎng)基(Vacant-beads)，不加任何包埋珠的培養(yǎng)基作為空白對照(Control). 3組實驗在70 r ·min-1，30℃條件下振蕩培養(yǎng)，分別于15、17、19、21、24、26、34、54 h進行取樣，并依據(jù)1.2節(jié)群體淬滅檢測所述方法，測量紫色圓直徑，根據(jù)公式(1)計算投加不同包埋珠的C6-HSL濃度隨時間的變化情況.

　　式中，c為C6-HSL濃度(μmol ·L-1);x為顯紫色圓直徑(mm).

　　1.6 生物膜生長鑒定

　　將PVDF材質(zhì)微濾膜片放入錐形瓶中，依次加入49 mL合成污水，1 mL實驗室馴化良好的活性污泥(MLSS=10 g ·L-1)，1.4節(jié)實驗結果證明無細菌包埋的海藻酸鈉珠對C6-HSL的降解能力與空白對照組無顯著差異可忽略不計(2.2節(jié))，故本節(jié)設置兩組實驗:不加包埋珠的錐形瓶作為對照組(A)，投加15顆SA-HG10的錐形瓶作為實驗組(B).在70 r ·min-1恒溫(30℃)條件下培養(yǎng)，每24 h進行人工配置污水更換，以提供反應系中微生物生長所需營養(yǎng)成分.經(jīng)過一個生物膜生長周期8 d后，取出微濾膜片，進行膜通量和生物膜EPS測量.

　　膜通量測定采用超濾杯(UFSC05001，Amicon，USA)自行搭建(圖 1)，氮氣提供穩(wěn)定正壓15 kPa±1 kPa，膜片置于超濾杯膜固定裝置內(nèi)，采用超純水(MilliQ water)作為過濾用水，過濾體積為50 mL，使用量筒和秒表分別記錄過濾水量和所需時間.

圖 1 膜通量測定裝置示意

　　膜表面生物膜中EPS的提取，采用熱提取法:將反應后膜片剪碎于15 mL 0.9% NaCl溶液中，超聲10 min，150 r ·min-1搖勻10 min，超聲5 min，80℃水浴30 min，取出碎膜片后，12 000 r ·min-1離心20 min，取上清液測定EPS含量，EPS總量用多糖與蛋白質(zhì)之和表征.多糖和蛋白質(zhì)分別采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法進行測定.

　　2 結果與討論

??????? 2.1 QQ功能菌株分離及鑒定結果

　　本研究共分離18株優(yōu)勢菌，對分離菌株全部進行群體感應淬滅功能驗證，得到5株具有群體淬滅功能的細菌. 圖 2為培養(yǎng)24 h時5株細菌的QQ功能檢驗，菌株HG10、A51、B1和B72培養(yǎng)24 h時，其上清液在濾紙周圍無顯紫色反應，表明菌株在24 h內(nèi)可將C6-HSL完全分解;而菌株C48在培養(yǎng)24 h后，其上清液在濾紙片周圍出現(xiàn)部分紫色，表明C48在培養(yǎng)24 h時能分解部分C6-HSL，群體淬滅功能較弱. 5種分離菌的16S rRNA基因鑒定結果如表 2所示.

培養(yǎng)時間: 24 h, C6-HSL溶液(10 μmol ·L-1)和超純水分別為陽性對照和陰性對照

圖 2 分離5種細菌的群體淬滅功能驗證

?

　　　　表 2 已分離群體感應淬滅菌株

?　　在天然環(huán)境中存在同時具有QS和QQ功能的細菌，對分離菌株的QS功能進行檢測.結果如圖 3，同屬于Burkholderia sp.屬的B72和C48自身可產(chǎn)生信號分子AHLs，其中菌株B72自身可生產(chǎn)短鏈類信號分子，C48可同時生產(chǎn)短鏈類和長鏈類信號分子.排除這兩株可自身生成AHLs的細菌，并結合之前QQ功能的檢驗，從余下3種菌株HG10、B1和B51中選取分解C6-HSL能力最強的HG10作為微生物固定包埋的實驗菌種.

C6-HSL和C10-HSL作為標準樣品

圖 3 分離細菌的群體感應功能檢測

　　2.2 固定化包埋菌的QQ功能檢驗

　　微生物在固定化包埋過程中，海藻酸鈉溶液濃度、交聯(lián)時間及交聯(lián)劑濃度等包埋條件均會影響固定化微生物性能，導致包埋菌活性降低. 圖 4為投放SA-HG10和空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)的LB培養(yǎng)基中，C6-HSL濃度隨時間的變化曲線.含有菌株HG10的海藻酸鈉包埋珠在培養(yǎng)17、19和21 h時，對溶液中C6-HSL的降解率分別為85%、96%和99%，表現(xiàn)出極強的群體感應淬滅功能;投放空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)的一組C6-HSL減少量僅為20%~26%，這可能是由于空海藻酸鈉珠的物理吸附作用造成. Khan等在對甲基狀芽孢桿菌研究中得出類似結果:在培養(yǎng)時間為16~23 h內(nèi)，甲基狀芽孢桿菌對信號分子C12-HSL的降解率可達到90%~96%.本研究中，用海藻酸鈉固定的菌株HG10在24 h對信號分子C6-HSL降解率達到99%以上，具有極強的群體淬滅功能.

圖 4 細菌包埋珠(SA-HG10)、無細菌空海藻酸鈉珠(Vacant-beads)對C6-HSL降解能力檢測

　　2.3 固定化菌株對膜污染的控制研究

?????? 2.3.1 微濾膜片外觀變化

　　于錐形瓶中取出培養(yǎng)8 d后的過濾膜片，微濾膜片表觀外貌如圖 5所示.未投加包埋珠的對照組A膜表面觀察到明顯的鞭毛狀絮體，已形成成熟生物膜.實驗組B濾膜表面微生物絮體附著量較少，表明投加SA-HG10細菌包埋珠對濾膜表面微生物的附著生長產(chǎn)生了抑制作用，進而控制膜污染的加劇.

A組和B組分別為未投加包埋珠和投加細菌包埋珠SA-HG10的測試濾膜，下同

圖 5 不同實驗條件下過濾膜片對比

　　2.3.2 膜通量變化

　　圖 6為不同反應體系中微濾膜過濾液體積隨時間的變化曲線，相比于新膜片過濾50 mL超純水需要90 s時間，實驗組B需要653 s，未投加任何包埋珠的對照組A則需更長時間(1 070 s)，膜過濾滲透性能開始下降，已出現(xiàn)明顯膜污染.通過公式(2)計算不同反應體系內(nèi)過濾膜通量.

　　式中，LMH為膜通量[L ·(m2 ·h)-1]，V50為過濾液體積(50 mL)，A為膜有效過濾面積(13.4 cm2)，t為過濾時間(s).

圖 6 不同反應體系膜過濾性能比較

　　得出B組膜通量為181.29 L ·(m2 ·h)-1，比對照組A的110.64 L ·(m2 ·h)-1高出63.9%，表明通過群體感應淬滅機制有效提高了膜通量. Monzon等提出，環(huán)境中微生物細菌高密度聚集并通過群體感應機制形成生物膜.本研究中，群體感應淬滅菌株HG10通過抑制上述過程的發(fā)生，使膜表面微生物的附著減少，膜污染程度顯著減緩.

　　2.3.3 EPS含量變化

　　大量研究表明，生物膜中胞外聚合物(EPS)是引起膜污染的主要污染物.微生物分泌而形成的胞外聚合物中，多糖和蛋白質(zhì)的含量可以占到其主要成分的60%~70%[30]，對過濾膜表面生物膜中EPS進行提取，并測定其多糖和蛋白質(zhì)含量，結果如圖 7所示.對照組(A)膜表面多糖和蛋白質(zhì)含量分別為11.43 μg ·cm-2和37.07 μg ·cm-2，而含有蠟樣芽孢桿菌包埋珠的實驗組(B)濾膜片上生物膜中多糖和蛋白質(zhì)含量分別為8.09 μg ·cm-2和19.32 μg ·cm-2，較對照組A分別減少了29%和48%.蛋白質(zhì)含量的大量減少很可能是造成生物膜形成減少的主要原因:蛋白質(zhì)屬疏水性物質(zhì)，Le-Clech等研究發(fā)現(xiàn)較多的疏水性物質(zhì)將會加強微生物絮體在膜表面的附著，同時提出相對于多糖，蛋白質(zhì)更易導致微生物絮體的疏水性. B組疏水性蛋白質(zhì)含量較多糖減少更多，導致膜表面疏水性物質(zhì)的大量減少，進而導致生物膜附著量的減少;B組胞外聚合物EPS較對照組A組減少了43%;Jiang等將海藻酸鈉包埋群體淬滅酶運用在膜生物反應器中，也發(fā)現(xiàn)膜組件表面EPS較對照組相比減少了大約50%，表明在本實驗中，群體感應淬滅技術對膜污染的減緩很可能是由于減少了生物膜中EPS含量而造成.具體參見污水寶商城資料或http://www.dowater.com更多相關技術文檔。

圖 7 無細菌包埋珠的對照組(A組)和含有細菌包埋珠的實驗組(B組)過濾膜表面多糖和蛋白質(zhì)含量

　　3 結論

　　(1)從實際運行的污水處理廠活性污泥中分離出1株新型群體感應淬滅菌HG10，初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus.

　　(2) HG10制成的包埋珠(SA-HG10)對群體感應信號分子C6-HSL具有99%的降解能力;其投加到模擬廢水過濾系統(tǒng)中，提高了63.9%的膜通量，改善了膜過濾性能，為該菌在實際工程應用中節(jié)省能耗和成本提供了理論基礎.